Этикетка

Биология связи, том 6, Номер статьи: 583 (2023) Цитировать эту статью

285 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Способность отображать химию клеток на наноуровне является ключом к пониманию клеточной биологии, но многие оптические микроскопы ограничены дифракционным пределом ~ (200–250) нм. Электронная микроскопия и флуоресцентные методы сверхвысокого разрешения превосходят этот предел, но для создания контраста изображения полагаются на окрашивание и специальную маркировку. Поэтому сложно получить информацию о функциональной химии внутриклеточных компонентов. Здесь мы демонстрируем метод внутриклеточного химического картирования без меток с наномасштабным (~ 30 нм) разрешением. Мы используем оптический микроскоп на основе зонда, освещаемый лазером среднего инфракрасного диапазона, длина волны которого возбуждает колебательные моды функциональных групп, встречающихся в биологических молекулах. В качестве демонстрации мы химически картируем внутриклеточные структуры в клетках множественной миеломы человека и сравниваем морфологию с электронными микрофотографиями той же клеточной линии. Мы также демонстрируем картирование без меток на длинах волн, выбранных для определения химических характеристик белков и нуклеиновых кислот, таким образом, чтобы его можно было использовать для идентификации биохимических маркеров при изучении болезней и фармакологии.

Стандартный путь к познанию ультраструктуры — электронная микроскопия (ЭМ) — использует образцы, окрашенные тяжелыми металлами для создания контраста электронного поглощения и электропроводности. Обычно их заключают в смолу, чтобы выдержать бомбардировку электронами в вакууме, и этот процесс занимает несколько дней. Более того, в отсутствие очень специфичной иммуномаркировки ЭМ-изображения предоставляют только морфологическую информацию и выявляют только особенности ультраструктуры, которые окрашиваются.

Разнообразные флуоресцентные микроскопы сверхвысокого разрешения также позволяют получать субдифракционные изображения клеточных структур1,2, но все они требуют меток, специфичных для рассматриваемой проблемы, и часто полагаются на априорное знание структур для эффективного мечения. На практике фотообесцвечивание флуорофоров, а также проблемы со стабильностью и специфичностью ограничивают точность локализации меток. Даже если такие технические проблемы будут преодолены, способность локализовать структуры ограничена расстоянием между целевой структурой и флуорофором, определяемым длиной используемых флуоресцентных меток и используемых связывающих молекул, которые обычно составляют несколько нанометров каждая3. Важно отметить, что существует также риск того, что маркировка нарушит биологию образцов1.

Инфракрасная (ИК) спектроскопия и визуализация широко используются для получения количественной химической информации без меток, но дифракционный предел обычно делает невозможным получение изображений на внутриклеточном уровне. Чтобы превзойти этот предел, было разработано несколько методов визуализации на основе зондов, которые сочетают в себе наноразмерную разрешающую способность атомно-силовой микроскопии (АСМ) с химической чувствительностью ИК-спектроскопии4,5. Мы используем сканирующую ближнепольную оптическую микроскопию рассеянного типа (s-SNOM), где АСМ-зонд освещается перестраиваемым ИК-лазером. Сбор и анализ ИК-излучения, рассеянного обратно из небольшой области, где взаимодействуют наконечник и образец, позволяет нам сделать вывод о свойствах ИК-поглощения материала образца в этой области. Настройка лазера позволяет нам получать изображения с химической специфичностью без необходимости окрашивания или маркировки. Важно отметить, что мы визуализируем сам биологический материал. Мы обнаруживаем ультраструктурные особенности, которые никогда раньше не визуализировались напрямую с помощью света, что повышает возможность обнаружения новых внутриклеточных структур, которые не обнаруживаются в ЭМ.

s-SNOM ранее использовался для визуализации изолированных биологических образцов, таких как белковые комплексы6,7,8, вирусы9 и амилоидные фибриллы10, а также для визуализации поверхности целых клеток11,12,13. Внутриклеточные структуры в клетках и тканях также были визуализированы в одноклеточных организмах14 и ткани сетчатки рыбок данио15 соответственно. Здесь мы опираемся на это путем химического картирования внутриклеточных структур в клетках множественной миеломы человека, включая, насколько известно авторам, первые непосредственно оптические субдифракционные изображения эндоплазматического ретикулума (ЭР), митохондрий (МТ) и фибриллярных компонентов в ядрышках. Изменяя длину волны освещения для воздействия на различные химические группы в клетках, мы также демонстрируем изоляцию ультраструктуры способом, который традиционно достигается только с помощью высокоспецифичной маркировки.